Минимакс - Доказательная медицина

Влияние наркозных препаратов на эффективность удаленного ишемического прекондиционирования

Авторы статьи:

Влияние наркозных препаратов на эффективность удаленного ишемического прекондиционирования
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского

Принятые сокращения: УИПК – удаленное ишемическое прекондиционирование конечностей, Зол – золетил, ОСМА – окклюзия средней мозговой артерии, ЛО – ложнооперированные животные, 5-HD – 5-гидроксидеканоат натрия, МРТ – магнитно-резонансная томография, ЭПО – эритропоэтин, BDNF – нейротрофический фактор мозга, pGSK-3β – фосфорилированная форма киназы гликогенсинтазы'3 бета, HSP70 – белок теплового шока 70, АФК – активные формы кислорода.

Удаленное ишемическое прекондиционирование конечностей (УИПК) является эффективным способом предотвращения повреждения головного мозга в результате ишемии. В то же время во многих исследованиях УИПК применяется на фоне анестезии наркозными препаратами, которые сами могут обладать нейропротекторными свойствами. Поэтому необходимо изучение как сигнальных путей, запускаемых УИПК, так и изменений этих путей под воздействием наркозных препаратов. В данной работе рассмотрено влияние анестетиков хлоралгидрата и золетила на способность УИПК защищать мозг от повреждений, вызванных ишемией/реперфузией. Было показано, что УИПК без анестезии приводит к статистически значимому снижению неврологической симптоматики через 24 ч после ишемии, но не оказывает влияния на объем повреждения. Введение хлоралгидрата или золетила за сутки до ишемии мозга само по себе оказывало прекондиционирующее воздействие на головной мозг, снижая выраженность неврологического дефицита, а в случае золетила и уменьшая объем инфаркта. Защитные эффекты при проведении УИПК на фоне золетила или хлоралгидрата были аналогичны таковым при применении только соответствующего наркозного препарата. УИПК сопровождалось значительным повышением в мозге уровня белков, ассоциированных с индукцией ишемической толерантности, таких как pGSK-3β, BDNF и HSP70. В то же время золетил не оказывал влияния на количество данных белков через 24 ч после инъекции, а хлоралгидрат вызывал повышение только pGSK'3β. Можно заключить, что УИПК, хлоралгидрат и золетил оказывают нейропротекторное действие, однако использование анестетиков одновременно с УИПК не приводит к усилению нейропротекции.

Ишемическое прекондиционирование, заключающееся в коротких периодах ишемии, предваряющих длительное прекращение кровоснабжения, является одним из наиболее эффективных методов защиты органов и тканей от ишемии/реперфузии. Впервые данный феномен был описан для сердца, но затем аналогичные механизмы были продемонстрированы для головного мозга, почек и скелетных мышц. Однако клиническое применение ишемического прекондиционирования в отношении головного мозга имеет серьезные ограничения в связи с возможными осложнениями, в частности, тромбозом сосудов даже при кратковременной ишемии мозга. В этой связи более привлекательным для клинического использования представляется метод удаленного ишемического прекондиционирования, заключающийся в кратковременных периодах ишемии/реперфузии в отдаленном органе (например, конечности или почке), которые в итоге обеспечивают защиту головного мозга от последующего ишемического повреждения. Было показано, что индукция удаленного ишемического прекондиционирования в конечностях (УИПК) или почке защищает головной мозг от ишемического инсульта. Очевидно, что процедура УИПК является более простым и безопасным методом по сравнению с удаленным прекондиционированием в других органах, поскольку не требует хирургического вмешательства и может быть выполнена, например, манжетой для тонометра. В то же время данные о клинической эффективности УИПК в отношении заболеваний сердца и головного мозга противоречивы. Так, в ряде исследований эффективность УИПК была подтверждена при сердечной недостаточности или инсульте, тогда как в других исследованиях был показан лишь незначительный защитный эффект или полное его отсутствие.

Кроме того, даже в случае доказанной эффективности УИПК остаются открытыми вопросы о механизме передачи защитных сигналов от удаленного органа к мозгу, задействованных сигнальных путях, а также оптимальной схеме индукции ишемической толерантности (количеству циклов ишемии/реперфузии и их длительности). Внедрение УИПК в медицинскую практику требует не только всестороннего изучения нейропротекторных механизмов, но и оценки взаимодействия УИПК с фармакологическими препаратами, например, анестетиками. Получено множество экспериментальных и клинических доказательств того, что некоторые анестетики защищают от повреждений, вызванных ишемией/реперфузией, такие органы, как сердце, мозг и почки. В недавних исследованиях было показано, что механизмы реализации защитного действия анестетиков имеют много общих компонентов с сигнальными путями ишемического прекондиционирования.

Важно отметить, что большая часть экспериментальных исследований нейропротекторных механизмов УИПК проводится на анестезированных животных. Следовательно, защитные сигналы анестетиков могут определенным образом взаимодействовать с сигнализацией, индуцируемой УИПК. Анестезия всегда используется при инвазивном УИПК (хирургическом доступе к сосудам, с рассечением тканей и зажимом бедренной артерии) и в большинстве случаев – при неинвазивном, когда наркоз используется главным образом для удобства исследователя с целью обездвиживания животного. Еще больше усложняет ситуацию в анализе защитных механизмов УИПК использование различных типов анестетиков – ингаляционных (изофлюран, севофлюран), инъекционных (хлоралгидрат, золетил) и др. Если в случае ингаляционных анестетиков известен ряд сигнальных путей, принимающих участие в выработке ишемической толерантности мозга, то для инъекционных форм данных имеется крайне мало. В частности, для одного из наиболее часто используемых в экспериментах на животных инъекционных анестетиков в недавнем исследовании был показан эффект прекондиционирования в первом (быстром) терапевтическом окне. Данные о возможности анестетического прекондиционирования другого наркозного препарата, золетила, пока не получены. Тем не менее очевидно, что между механизмами приобретения ишемической толерантности, опосредованными УИПК или анестезией, возможно сложное взаимодействие, требующее специального изучения для объективной оценки нейропротекторной эффективности УИПК.

Целью данного исследования являлась оценка влияния анестетиков хлоралгидрата изолетила на способность УИПК защищать мозг от повреждений, вызванных ишемией/реперфузией.

Материалы и методы

Моделирование ишемии головного мозга

В работе использовались беспородные крысы массой 320–350 г, содержавшиеся в условиях вивария с 12-часовым световым циклом при постоянной температуре (22 ± 2) °С. При работе с животными соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 2010/63/EU об использовании животных для экспериментальных исследований.

Животных перед операцией анестезировали хлоралгидратом (300 мг/кг, внутрибрюшинно). Ишемию инициировали односторонней окклюзией средней мозговой артерии (ОСМА) нейлоновой нитью, покрытой силиконом. Выполняли срединный разрез в области шеи и выделяли правую общую сонную артерию, внешнюю сонную артерию и внутреннюю сонную артерию. Накладывали лигатуру на внешнюю и внутреннюю сонную артерии и микрососудистую клипсу на общую сонную артерию, после чего перерезали внешнюю сонную артерию дистальнее наложения нити. Гепаринизированную нейлоновую нить диаметром 0,25 мм, покрытую силиконом, вводили через культю внешней сонной артерии во внутреннюю сонную артерию на глубину 19–20 мм (до перекрытия среднемозговой артерии) и фиксировали клипсой. Перекрытие кровотока сохранялось в течение 60 мин, после чего нить извлекали из сосуда, восстанавливая кровоснабжение в бассейне средней мозговой артерии. Во время операции и после нее температура тела животного поддерживалась на уровне 37,0 ± 0,5°С. Ложнооперированные (ЛО) животные подвергались тем же процедурам, за исключением перерезки сосудов и введения нити.

Прекондиционирование с помощью ишемии задних конечностей

Ишемическое прекондиционирование задних конечностей проводили неинвазивно с помощью пережатия нейлоновым жгутом одной лапы в течение 5 мин с последующим 5-мин реперфузионным интервалом, с трехкратным повторением цикла. Для контроля кровотока в задних конечностях использовали высокочастотную ультразвуковую допплеровскую технику с частотой 27 МГц («Минимакс-Допплер», Россия). Кровоток, перекрытый в течение 5 мин, полностью восстанавливался после снятия жгута (рис. 1, а). УИПК проводили за 24 ч до моделирования фокальной ишемии мозга. Были проведены три экспериментальные серии (рис. 1, б). Животных из первой серии использовали для исследования нейропротекторных эффектов УИПК без анестезии. Для адаптации животных размещали в фиксаторе на 30 мин в течение трех дней перед операцией. УИПК и ложное прекондиционирование (без пережатия конечностей) проводили на бодрствующих крысах, помещенных в фиксатор. Животных случайным образом делили на три группы: ОСМА (n=11) – крысы, у которых индуцировали ишемию мозга, как описано выше; ОСМА+УИПК (n=13) – крысы с ишемией мозга, получавшие прекондиционирование конечностей за 24 ч перед операцией; ОСМА+ЛО_УИПК (n=6) – крысы c ишемией мозга, не получавшие прекондиционирование задних конечностей, но помещавшиеся в фиксатор.

Влияние наркозных препаратов на эффективность удаленного ишемического прекондиционирования

Для изучения роли KATP-каналов в реализации феномена удаленного ишемического прекондиционирования использовали специфический ингибитор этих каналов – 5-гидроксидеканоат натрия (5-HD), который вводили внутрибрюшинно в дозе 40 мг/кг за 30 мин до прекондиционирования задних конечностей (ОСМА+УИПК+5-HD, n = 6). Через 24 ч после моделирования ОСМА у животных определяли неврологический статус в тесте «Постановка конечности на опору».

Во второй серии экспериментов изучали влияние анестетика хлоралгидрата на эффективность УИПК. Животных также делили на три группы: ОСМА (n=7) – крысы с ишемией мозга; ОСМА+хлоралгидрат (ХГ) (n=6) – животные, получавшие внутрибрюшинно инъекцию хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг за 24 ч до моделирования ишемии; ОСМА+ХГ+УИПК (n=8) – крысы, получавшие прекондиционирование конечностей с анестезией хлоралгидратом за 24 ч до ишемии мозга.

В третьей серии экспериментов исследовали влияние золетила (Зол) на эффекты УИПК. Было сформировано три экспериментальных группы: ОСМА (n=11) – крысы с ишемией мозга; ОСМА+Зол (n=6) – животные, получавшие внутрибрюшинно инъекцию золетила в дозе 40 мг/кг за 24 ч до моделирования ишемии; ОСМА+Зол+УИПК (n=6) – крысы, получавшие прекондиционирование конечностей с анестезией золетилом за 24 ч до ишемии мозга.

Исследование сигнальных путей, вовлеченных в индукцию ишемической толерантности

С целью изучения влияния УИПК и анестетиков на сигнальные пути, вовлеченные в индукцию ишемической толерантности в головном мозге, было сформировано пять экспериментальных групп: животные с УИПК и ложным УИПК; животные, получавшие внутрибрюшинную инъекцию хлоралгидрата в дозе 300 мг/кг или золетила в дозе 40 мг/кг, а также группа интактных крыс. В каждой группе было по шесть животных. Крыс декапитировали через 24 ч после воздействия для получения гомогенатов ткани мозга (см. подраздел «Вестерн-блоттинг»).

Оценка сенсомоторных функций головного мозга

Тест «Постановка конечности на опору» применяли для оценки сенсомоторных нарушений. Использованный протокол основан на методике, описанной Jolkkonen et al. Крысы были приучены к рукам за три дня до операции. Неврологический статус оценивали у животных до индукции ишемии, а также на 1-е сутки после моделирования ишемии. Тест состоял из семи испытаний, оценивающих сенсомоторную интеграцию передних и задних конечностей в ответ на тактильную, проприоцептивную и зрительную стимуляции. Тест оценивали следующим образом: крыса выполняла испытание нормально – 2 балла; крыса выполняла испытание с задержкой (>2 с) и/или не полностью – 1 балл; крыса не выполняла испытание – 0 баллов.

Оценка объема повреждения головного мозга

Головной мозг всех экспериментальных животных исследовали методом магнитно-резонансной томографии (МРТ) на 1-е сутки после операции. Все МРТ-эксперименты были выполнены, как описано ранее, на приборе BioSpec 70/30 («Bruker», Германия) с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 мТл/м. Морфометрический анализ МР-изображений проводили, используя программу ImageJ (National Institute of Health, США). Подсчитывали объем инфаркта, который для каждой группы был нормализован к средему значению группы ОСМА. Степень отека мозга оценивали, используя формулу:

Влияние наркозных препаратов на эффективность удаленного ишемического прекондиционирования

Определение содержания эритропоэтина в моче

Содержание эритропоэтина (ЭПО) определяли в моче животных методом иммуноферментного анализа. Животных сразу после проведения УИПК помещали в обменные клетки и собирали мочу в течение последующих 24 ч. Мочу концентрировали методом ультрафильтрации в пробирках Centricon YM 30 («Millipore», США) путем центрифугирования в соответствии с проколом производителя. Концентрат мочи использовали для количественного определения ЭПО в соответствии с инструкциями изготовителя тест-системы («R&D Systems», США).

Вестерн-блоттинг

Содержание нейротрофического фактора мозга (BDNF), фосфорилированной формы киназы гликогенсинтазы-3 бета (pGSK-3в) и белка теплового шока 70 (HSP70) определяли методом вестерн-блоттинга в гомогенатах головного мозга, полученных через 24 ч после проведения УИПК или внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата или золетила. После декапитации животного мозг быстро извлекали и охлаждали в PBS. Для анализа брали все структуры головного мозга, кроме мозжечка и продолговатого мозга, измельчали и затем гомогенизировали в 5 мл PBS, содержавшем 1 мМ ингибитора протеаз PMSF. Электрофоретическое разделение белков гомогенатов головного мозга проводили в 12,5%-ном ПААГ в денатурирующих условиях. По окончании электрофореза белки переносили на PVDF-мембрану («Amersham Pharmacia Biotech», Великобритания), которую блокировали в течение 12 ч при 4 °С в Tris-буферной среде, содержавшей 5% обезжиренного сухого молока. Мембрану инкубировали сначала с первичными кроличьими антителами к BDNF, pGSK-3β или HSP70 («Cell Signaling», США) в разведении 1:1000, а затем со вторичными антикроличьими IgG, ассоциированными с пероксидазой хрена, в разведении 1:10 000 («Jackson ImmunoResearch», США). Сигнал регистрировали с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL Еnhanced Chemiluminescence System («Amersham Pharmacia Biotech», Великобритания), используя прибор V3 Western Blot Imager («Bio'Rad», США). Полученные изображения анализировали с помощью программы ImageLab.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы Statistica 7.0 («StatSoft», США). Нормальность распределения признака в выборке оценивали по W-критерию Шапиро–Уилка. Все данные представлены в виде среднего ± s.е.m. за исключением баллов неврологического тестирования, представленных в виде медианы (верхний квартиль – нижний квартиль). Для оценки статистической значимости объема инфаркта и отека головного мозга использовали однофакторный ANOVA-тест с критерием Tukey. Статистические различия в тесте «Постановка конечности на опору» анализировали критерием Краскела–Уоллиса с внутригрупповым сравнением U-критерием Манна–Уитни. Значение P<0,05 принимали за уровень статистической значимости. Статистические различия данных вестерн-блоттинга анализировали с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования

Нейропротекторные эффекты УИПК

Анализ головного мозга крыс с помощью МРТ через 24 ч после ишемии/реперфузии показал обширное повреждение сенсомоторной коры и стриатума, а также частичные повреждения гипоталамуса и миндалевидного тела, расположенных вне сосудистой территории средней мозговой артерии (рис. 2, а). Средний объем повреждения в группе ОСМА составил (261 ± 20) мм3, а отек поврежденного полушария в среднем был равен (16,9 ± 2,6) % (рис. 2, в). Прекондиционирование задних конечностей за 24 ч до ОСМА не оказывало влияния на объем повреждения и степень отека мозга (рис. 2, а–в), которые составили (261 ± 20) мм3 и (16,4 ± 1,4) % соответственно. Кроме того, ОСМА вызвала значительную сенсомоторную недостаточность, определяемую в конечностях, контралатеральных по отношению к поврежденному полушарию. Если интактные крысы до моделирования инсульта набирали 14 (14–14) баллов в тесте «Постановка конечности на опору», а ложнооперированные – 13,75 (13,2–14) баллов, то у крыс после ишемии неврологический статус составлял только 2 (2–2,5) балла. УИПК снижало неврологический дефицит и приводило к статистическому значимому увеличению неврологического статуса (рис. 2, г) до 4 (4–6) баллов (P <0,05). Результаты у животных с ложным прекондиционированием задних конечностей перед ОСМА не отличались от группы ОСМА по всем показателям.

Влияние наркозных препаратов на эффективность удаленного ишемического прекондиционирования

Нейропротекторные эффекты УИПК с использованием хлоралгидрата во время прекондиционирования

Внутрибрюшинное введение хлоралгидрата за 24 ч до ОСМА не влияло на объем инфаркта и отек мозга, так же как УИПК с использованием хлоралгидрата во время прекондиционирования (рис. 3, а–г). Однако и хлоралгидрат, и УИПК на фоне хлоралгидрата вызывали восстановление неврологических функций до 8 (5–8) и 7 (5,25–7,25) баллов соответственно (P < 0,05) (рис. 3, г).

Нейропротекторные эффекты УИПК с использованием золетила во время рекондиционирования

Объем зоны повреждения мозга в группах животных, получивших за 24 ч до ишемии внутрибрюшинную инъекцию золетила или подвергшихся УИПК на фоне анестезии золетилом, снижался до (68,7 ± 7,6)% (P < 0,05) и (54 ± 7,6)% (P < 0,05) по сравнению с группой ОСМА (рис. 4, а, б). Предварительное воздействие золетила статистически значимо снижало отечность мозга после ОСМА (P<0,05), аналогичное двукратное уменьшение отека наблюдалось при УИПК (рис. 4, в). Неврологическое тестирование животных выявило снижение неврологического дефицита через 24 ч после начала реперфузии (рис. 4, г): в группе ОСМА + Зол неврологический статус возрастал до 4,5 (3,25–5,75) баллов, а в группе ОСМА + Зол + УИПК – до 4 (3–5,75) баллов (P < 0,05 по сравнению с группой ОСМА).

Влияние наркозных препаратов на эффективность удаленного ишемического прекондиционирования

Рис. 4. Нейропротекторные эффекты УИПК с использованием золетила во время прекондиционирования. а – Репрезентативные T2-взвешенные МР'изображения, полученные через 24 ч после ОСМА (толщина среза 0,8 мм). Область повышенного гиперинтенсивного сигнала (светлая область) соответствуют зоне ишемии; объем инфаркта (б) и отек мозга (в), вычисленные морфометрическим анализом T2'взвешенных МР-изображений; г – неврологический статус, оцененный с помощью теста «Постановка конечностей на опору». Данные представлены в виде медианы (черная жирная линия), интерквартильного размаха и края статистически значимой выборки. * P < 0,05 по сравнению c группой ОСМА, однофакторный ANOVA-тест с критерием Tukey (б, в), критерий Краскела–Уоллиса с внутригрупповым сравнением U-критерием Манна–Уитни (г)

Исследование сигнальных путей ишемической толерантности

Основываясь на полученных нами данных, что УИПК, хлоралгидрат и золетил вызывали улучшение неврологических исходов после ишемии, мы проанализировали некоторые сигнальные пути, вовлеченные в выработку ишемической толерантности мозга. Измерения содержания pGSK-3β, HSP70 и BDNF проводили в головном мозге через 24 ч после УИПК или внутрибрюшинной инъекции анестетиков. У животных с УИПК уровни BDNF и HSP70 возрастали до 320 и 180% соответственно (рис. 5, а, д), и в 4 раза увеличивался уровень pGSK-3βв мозге по сравнению с группой ЛО_УИПК (рис. 5, в). В то же время оцененный методом ИФА уровень ЭПО в суточной моче у животных после УИПК составил (78 ± 18) пг/л и не показал статистически значимых различий по сравнению с животными после ложного прекондиционирования, где данный параметр составил (104 ± 22) пг/л. Хлоралгидрат вызывал увеличение только pGSK-3β на 60% (рис. 5, г) по сравнению с контрольными животными, тогда как золетил не оказывал влияния на уровни pGSK'3β, HSP70 и BDNF в головном мозге (рис. 5, б, г, е). Введение ингибитора KATP-канала 5-HD полностью отменяло нейропротекторный эффект УИПК, приводя к снижению баллов в неврологическом тестировании до уровня животных группы ОСМА (рис. 6). Объем повреждений при этом значимо не изменялся, оставаясь сходным с группой ОСМА.

Влияние наркозных препаратов на эффективность удаленного ишемического прекондиционирования

Риc. 5. Исследование сигнальных путей ишемической толерантности. Оценка уровня BDNF (а, б), фосфорилирования GSK-3β (в, г) и HSP70 (д, е) в головном мозге через 24 ч после УИПК без анестезии или внутрибрюшинной инъекции анестетиков методом вестерн-блоттинга. Представлены репрезентативные вестерн-блоты и результаты их денситометрического анализа. Плотности пятен нормализованы на βIII-тубулин

Влияние наркозных препаратов на эффективность удаленного ишемического прекондиционирования

Рис. 6. 5-Гидроксидеканоат (5-HD) отменяет нейропротекторный эффект УИПК. Данные представлены в виде медианы (черная линия), интерквартильного размаха и края статистически значимой выборки. *P<0,05 по сравнению c группой ОСМА (U-критерий Манна–Уитни)

Обсуждение результатов

В данном исследовании мы подтвердили возможность защиты мозга от негативных последствий ишемии/реперфузии методом удаленного ишемического прекондиционирования задних конечностей. Хотя мы сумели отделить эффекты УИПК от эффектов, используемой во время прекондиционирования анестезии, наши результаты указывают на возможность сложных взаимодействий между протекторными эффектами анестетиков и собственно прекондиционирования.

Согласно нашим результатам, в отсутствие анестетиков УИПК, проведенное за 24 ч до моделирования ишемии, не оказывало влияния на объем инфаркта или степень отека головного мозга, однако статистически значимо улучшало сенсомоторные функции на 1'е сутки после инсульта. Важно отметить, что улучшение сенсомоторных функций происходило во всех группах, получивших УИПК, как с анестезий, так и без нее, но мы не выявили статистически значимых различий в улучшении неврологического статуса между этими группами животных. Следовательно, можно говорить об отсутствии как синергизма, так и антагонизма во взаимодействии изученных нами анестетиков и УИПК.

Анестетик хлоралгидрат, введенный крысам за 24 ч до индукции ишемии, так же как и УИПК, не влиял на степень повреждения мозга, но улучшал сенсомоторные функции. Исходя из этих данных, мы предполагаем наличие собственного прекондиционирующего эффекта хлорал-гидрата, равного по эффективности УИПК. Полученные данные о нейропротекторных эффектах хлоралгидрата подтверждают и дополняют результаты более раннего исследования Liu et al., показавших, что внутрибрюшинная инъекция хлоралгидрата за 1 ч до ОСМА значительно улучшает неврологический статус у крыс, а также снижает объем повреждения и отек мозга после ишемии посредством повышения уровня аннексина А1. Помимо этого существуют свидетельства системного противовоспалительного действия хлоралгидрата, которое может быть вовлечено в нейропротекторные механизмы хлоралгидрата. Исследования на кардиомиоцитах также показали, что хлоралгидрат способствует открытию KATP-каналов, что может являться частью механизма его нейропротекторного действия, поскольку KATP-каналы играют важную роль в начальной фазе ишемического прекондиционирования.

Другой исследованный нами анестетик золетил, состоящий из равных частей антагониста NMDA-рецепторов тилетамина и агониста ГАМК'рецепторов золазепама, часто используется в экспериментальной хирургии из-за ряда преимуществ, таких как быстрая индукция наркоза, высокоэффективное расслабление мышц и обеспечение ровного течения процесса выхода из наркоза. Золетил в наших экспериментах проявлял выраженное нейропротекторное действие, снижая объем инфаркта и отек мозга. Аналогичные результаты были получены для группы УИПК на фоне золетила. Также было выявлено статистически значимое снижение неврологического дефицита в равной степени в обеих группах, получавших только золетил или золетил в условиях прекондиционирования. Поскольку золетил является комбинированным препаратом, то механизм его прекондиционирующего действия может быть комплексным. С одной стороны, антагонисты NMDA-рецепторов могут индуцировать сигналы, сходные с прекондиционированием. С другой, антагонисты рецепторов ГАМК могут обладать сходным действием с прекондиционированием и оказывать защитное действие на сердце, но этим свойством не обладают агонисты, в частности золазепам. Стоит отметить, что в нашей работе золетил использовался в достаточно высоких дозах (40 мг/кг), в которых помимо влияния на NMDA' и ГАМК-рецепторы он может, например, ингибировать различные звенья дыхательной цепи. Такое ингибирование способно приводить к повышению продукции активных форм кислорода (АФК), сигнализация от которых через протеинкиназу C и KATP-каналы способна запускать индукцию ишемической толерантности.

С целью выявления структуры защитных сигнальных путей мы исследовали содержание в мозге белков BDNF, HSP70 и pGSK-3β, вовлеченных в выработку ишемической толерантности мозга под действием УИПК и анестетиков. Хорошо известно, что нейротрофический фактор мозга относится к семейству нейротрофинов, члены которого способствуют росту, дифференцировке и выживанию нейронов. Ишемическое или гипоксическое прекондиционирование головного мозга вызывает увеличение уровня экспрессии мРНК BDNF в мозге крыс, а введение самого BDNF в желудочки мозга оказывает нейропротекторное действие, продемонстрированное в различных моделях ишемии мозга, в т.ч. ОСМА. Нами также было показано, что содержание BDNF в мозге увеличивается в несколько раз через сутки после УИПК, что может вызывать запуск нейропротекторных механизмов, индуцируемых BDNF. Также УИПК вызывало увеличение уровня экспрессии HSP70 в мозге. Аналогичные результаты были ранее получены на модели глобальной ишемии, где УИПК повышало содержание HSP70 в поле CA1 гиппокампа, тогда как кверцетин или SB203580, являющиеся ингибиторами HSP70, отменяли защитный эффект прекондиционирования. В различных работах было показано, что увеличение содержания HSP70 в мозге ассоциировано с нейропротекцией, так, гиперэкспрессия HSP70 у трансгенных мышей повышает выживаемость нейронов после фокальной ишемии. Получены убедительные доказательства участия HSP70 в индукции ишемической толерантности мозга после ишемического прекондиционирования.

Рассматривая механизмы индукции ишемической толерантности в мозге и других органах, большинство авторов в качестве одного из ключевых участников называют митохондриальный КАТР-канал. Открытие этих каналов вызывает небольшое набухание митохондрий, которое активирует образование сигнальных АФК, стимулирует протеинкиназу С и приводит к фосфорилированию GSK'3β, что в итоге ингибирует открытие митохондриальной поры. Вопрос о роли GSK'3β в УИПК остается малоизученным, однако в недавнем исследовании было обнаружено увеличение количества фосфорилированной формы GSK'3β в почке через сутки после кратковременной ишемии конечностей. Ранее в нашей лаборатории было показано, что увеличение фосфорилирования этой киназы лежит в основе действия некоторых нефро- и нейропротекторов, а также при прекондиционировании почки. В данной работе мы также изучали участие этого механизма в индукции нейропротекции, показав, что уровень pGSK'3β увеличивается через сутки после нанесения стимулов УИПК или инъекции хлоралгидрата. Можно предположить, что это приводило к повышению порога открытия митохондриальной неспецифической поры и защите клеток мозга от гибели, вызванной ишемией/реперфузией.

Ранее нами было показано, что повышение уровня продукции ЭПО почками – один из возможных механизмов генерации защитных стимулов в ответ на удаленное ишемическое прекондиционирование почки. Аналогичные результаты были получены в работе, рассматривающей механизмы УИПК, в которой авторы объясняют повышение ЭПО уменьшением ренального кровотока в ответ на УИПК, в результате чего активируется HIF'1α'зависимый путь продукции ЭПО. В нашей работе мы не выявили изменения содержания ЭПО в суточной моче животных, что совпадает с данными, полученными Malhotra et al. Подобные противоречия экспериментальных результатов могут быть связаны, по'видимому, c использованием в этих работах различных схем прекондиционирования и наркозных препаратов, что еще раз подчеркивает актуальность проведения исследований влияния фармакологических воздействий на реализацию феномена УИПК.

Можно заключить, что удаленное ишемическое прекондиционирование задних конечностей без предварительного использования анестетиков приводит к восстановлению сенсомоторных функций головного мозга после моделирования ишемии/реперфузии. С одной стороны, на фоне применения анестетиков при проведении прекондиционирования задних конечностей не происходит усиление нейропротекции. С другой стороны, мы не можем детектировать защитный эффект УИПК из-за наличия аналогичного эффекта у самого анестетика. Эти данные указывают на то, что для изучения защитных эффектов и сигнальных путей УИПК в экспериментальных исследованиях необходимо использовать метод прекондиционирования без применения анестетиков.

Тот факт, что анестетики сами оказывали защитное действие при отсутствии аддитивного эффекта с УИПК, может быть объяснен реализацией их нейропротекторного действия через сходные механизмы. Это сходство может состоять в том, что нейропротекция коррелирует с уровнем фосфорилирования киназы GSK'3β в мозге, которая по множеству ранних данных является местом схождения разных защитных путей. В итоге все сигнальные защитные пути ишемического и фармакологического прекондиционирования (включая и найденные в этой работе при УИПК и действии хлоралгидрата) имеют в качестве терминального элемента этот фермент в фосфорилированной (ингибированной) форме. Ранние данные о том, что основная роль GSK'3β состоит в предотвращении индукции неспецифической проницаемости митохондрий, являющейся точкой невозврата в гибельном каскаде клетки, ставит как эту киназу, так и митохондрии в целом в центр внимания исследователей в качестве мишени для использования известных и разработки новых протекторных фармакологических агентов. Мы не выявили изменений в содержании уровня фосфорилирования GSK'3β у животных, получавших золетил, однако этот препарат оказывал более выраженное нейропротекторное действие, вызывая снижение объема повреждения и отека головного мозга в отличие от УИПК и хлоралгидрата. Эти факты могут говорить о наличии у золетила иного механизма реализации нейропротекторного действия. Таким образом, требуется отдельное расширенное изучение влияния анестетиков на сигнальные пути, вовлеченные в индукцию ишемической толерантности. Клинические и экспериментальные исследования феномена ишемического прекондиционирования должны проводиться с учетом возможного влияния анестетиков на реализацию конечного терапевтического эффекта.

Все статьи

Хирургия, нейрохирургия

Стоматология, ЧЛХ

Эндокринология

Травматология

Флебология, заболевания нижних конечностей

©1992 - 2019 All rights reserved | "Минимакс"